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WB尝试操做流程

更新时间:2019-05-26    点击次数:

 

  WB尝试操做流程_生物学_天然科学_专业材料。Western Blot 尝试操做指南 Western Blot 即卵白质印迹法(免疫印迹试验) ,是生物学、生物化学和免疫遗 传学中常用的一种尝试方式。其根基道理是通过性抗体对凝胶电泳处置过

  Western Blot 尝试操做指南 Western Blot 即卵白质印迹法(免疫印迹试验) ,是生物学、生物化学和免疫遗 传学中常用的一种尝试方式。其根基道理是通过性抗体对凝胶电泳处置过的细胞或生 物组织样品中的特定卵白进行显影。通过度析显影的和显影深度获得特定卵白质正在所 阐发的细胞或组织中表达环境的消息。 尝试流程 次要包罗以下几个步调: 样品制备;SDS-PAGE 凝胶电泳;转膜;封锁;免疫杂交;显影。 尝试器材 操做步调 样品制备 预备进行 western blot 的样品可分为细胞、组织、免疫沉淀或亲和纯化后的卵白等。样品 为卵白溶液时不需要进行提取,而样品为细胞、组织或包埋组织等则需要按照样品的特征 对其进行提取。按照需求分歧还可针对于细胞亚布局进行提取。 (1)以体外培育的贴壁细胞样本为例,对其进行总卵白提取: 1、 倒掉培育液,并将瓶倒扣正在吸水纸上使吸水纸吸干培育液(或将瓶曲立放置一会儿使 培育液流到瓶底然后再用移液器将其吸走) 。 2、 每瓶细胞加 3ml 4℃预冷的 PBS(0.01M pH7.2~7.3) 。平放悄悄摇动 1min 洗涤细 胞,然后弃去洗液。反复以上操做两次,共洗细胞三次以洗去培育液。将 PBS 弃净后把培 养瓶置于冰上。 3、 按 1ml 裂解液加 10 μl PMSF(100mM) ,摇匀置于冰上。 (PMSF 要摇匀至无结晶 时才可取裂解液夹杂。 ) 4、 每瓶细胞加 400 μl 含 PMSF 的裂解液,于冰上裂解 30min,为使细胞充解培育 瓶要经常来回摇动。 5、 裂解完后,用清洁的刮棒将细胞刮于培育瓶的一侧(动做要快) ,然后用枪将细胞碎 片和裂解液移至 1.5ml 离心管中。 (整个操做尽量正在冰长进行。 ) 6、 于 4℃下 12000rpm 离心 5min。 (提前开离心计心情预冷) 7、 将离心后的上清分拆转移倒 0.5min 的离心管中放于-20℃保留。 (2)以哺乳动物组织样本为例,对其进行总卵白提取: 1. 将 100 mg 组织剪切成小块,插手适量的冰凉 PBS 洗涤两次后,4℃,700×g(3000 rpm) 离心 3 min,弃上清。20mg 组织插手 100μl 裂解液,置玻璃匀浆器冰上均质 30~ 50 次。(如利用组织匀浆机,则按照 20 mg 组织插手 100 μl 裂解液的比例插手裂解液。 每个试管插手 2 个曲径 2 mm 的磁珠。将试管放入组织匀浆机中,60 HZ,300s。充 解后,10000 g 离心 5 min,取上清。) 2. 最大速度涡旋震动 10sec,冰上放置 20 min,期间取出震动 3-5 次,再于 4℃, 12000 rpm 离心 10 min,以沉淀组织或细胞碎片,取上清。 生工相关产物: 产物编号 产物名称 产物编号 C500005、 产物名称 细胞核卵白/浆蛋 C510001 白抽提试剂盒 C510006、 RIPA 裂解液 I~IV C500007、 C500008 膜卵白、核卵白和 动物全卵白提取试 C510002 胞质卵白抽提试剂 盒 C510003 剂盒 膜卵白和胞质卵白 C510005 提取试剂盒 细胞核卵白质提取 C500009 试剂盒 胞质和线 质提取试剂盒 动物卵白提取试剂 C500053 盒 一步法动物活性蛋 C510004 白质提取试剂盒 一步法动物组织活 C500006 性卵白提取试剂盒 一步法动物细胞活 C500022 性卵白提取试剂盒 C500026 C500023 C510020 C500073 C500049 C500058 白腊包埋组织卵白 提取试剂盒 膜卵白提取试剂盒 亚细胞布局卵白提 取试剂盒 一步法虫豸细胞活 性卵白提取试剂盒 一步法细菌活性蛋 白提取试剂盒 一步法酵母活性蛋 白提取试剂盒 卵白定量 卵白定量是做 WB 尝试的根本。 卵白定量的目标是:统一组中的分歧样本的卵白总量连结分歧,只要如许,wb 成果的 内参、灰度等数据才可托。不然尝试数据没有参考价值。 卵白定量的方式良多,常用的有 Lowry 法、BCA 法、紫外接收法、Biuret 法、这些方式各 有优错误谬误。该当按照具体尝试选择分歧的尝试方式进行卵白定量。 示例:BCA 法卵白定量 1. 按照样品数量,按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B(50:1)配制适量 BCA 工做 液,充实混匀。BCA 工做液室温 24 小时内不变。 2. 完全消融卵白尺度品,取 10ul 稀释至 100ul,使终浓度为 0.5mg/ml。卵白样品正在什么 溶液中,尺度品也宜用什么溶液稀释。可是为了简洁起见,也能够用 0.9%NaCl 或 PBS 稀 释尺度品。 3. 将尺度品按 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20ul 加到 96 孔板的尺度品孔中,加用于稀释尺度品的 溶液补脚到 20ul。 4. 加恰当体积样品到 96 孔板的样品孔中,加用于稀释尺度品的溶液至 20ul。 5. 各孔插手 200ulBCA 工做液,37℃放置 30 分钟。 注: 也能够室温放置 2 小时,或 60℃放置 30 分钟。BCA 法测定卵白浓度时,吸光度会随 着时间的耽误不竭加深。而且显影反映会因温度升高而加速。若是浓度较低,适合正在较高温 度孵育,或耽误孵育时间。 6. 测定 A562,540-595nm 之间的波长也可接管。按照尺度曲线计较出卵白浓度。 凝胶电泳 Western blot 凡是利用 SDS-PAGE 进行电泳。 按照本身卵白的量选择 SDS-PAGE 的浓度, 如卵白量未知能够选择梯度凝胶。 能够选择便宜聚丙烯酰胺凝胶或采办预制胶。 以 SDS-PAGE10%便宜胶为例,预备进行凝胶电泳: 1. 按照卵白的量确定好 SDS-PAGE 胶的浓度,拆卸好灌胶的模具。 2. 进行分手胶的设置装备摆设,取一个烧杯,按照配方插手适量的聚丙烯酰胺溶液,10%SDS,分手 胶缓冲液,混匀。插手适量的过硫酸铵和 TEMED,悄悄搅拌(注:不要发生气泡) ,将此液 体迟缓插手到模具内。 3. 插手分手胶后悄悄正在分手胶溶液上笼盖上水。 4. 期待 30~60min,待凝胶聚合后,分手胶和水层呈现一个清晰的界面,吸尽分手胶上的 水。 5. 进行浓缩胶的设置装备摆设,取一个烧杯,按照配方插手适量的聚丙烯酰胺溶液,10%SDS,浓缩 胶缓冲液, 混匀。 按照配方插手适量的过硫酸铵和 TEMED, 悄悄搅拌 (注: 不要发生气泡) , 将此液体迟缓插手到分手胶的,曲至灌满,将梳子插入凝胶内(梳子齿结尾没有气 泡) 。 6. 期待 30min 摆布,待凝胶聚合后小心拔出梳子,将制好的凝胶及玻璃板放入电泳槽内并 拆卸好。 7. 将电泳缓冲液插手表里槽中,使凝胶的上下两头均能浸泡正在电泳缓冲中。 8. 将制备好的样品取上样缓冲液按比例夹杂,95℃~100℃加热 3~5min,取 15ul(可按照 试验环境进行调整)将样品插手到凝胶孔中,同时必需正在统一片胶的孔中插手卵白 marker 做为参照。 9. 接通电源进行电泳,察看 marker,待 maker 显示的方针卵白取其他卵白较着分手遏制 电泳, 一般环境下是等溴酚蓝标识表记标帜的样本跑出凝胶, 方针卵白的量分歧电泳遏制的时间 分歧,视尝试而定。 生工相关产物: 产物编号 产物名称 SDS-PAGE 变性丙 产物编号 产物名称 Precast-GL 预 制 C631100 烯酰胺凝胶快速制 备试剂盒 C621100 胶 7.5% 10 孔(用 于变性电泳) Precast-GL 预 制 C621101 胶 10% 10 孔(用 于变性电泳) Precast-GL C621103 预制胶 15% 10 孔 (用于变性电泳) Precast-GL 预 制 C621104 C621102 Precast-GL 预 制 胶 12% 10 孔(用 于变性电泳) Precast-GL 预 制 胶 4~15% 10 孔 (用于变性电泳) 5 x 卵白质加样缓 C621105 胶 4~20% 10 孔 (用于变性电泳) 10 x Tris-Glycine TureColor 双色预 C506023 Gel Running Buffer 蛋 白 非 预 染 C600525 Marker IV,中 量范畴 C600524 卵白非预染 Marker III,平分 子量范畴 C610011 染卵白 Marker C508320 冲液 转膜 转膜是将卵白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到膜上的过程。转膜的方式可分为半干转和湿 转,湿转法转膜效率较高,利用转膜液多,转膜时需要冷却,半干转转膜时间短,需要的 转膜液少,不适合转移高量卵白质。 膜能够选择 PVDF 膜和 NC 膜。PVDF 膜取目标卵白连系能力较高,活络度高,不易 破裂,可合用于再次标识表记标帜(利用前需要浸泡正在甲醇中激活) 。NC 膜不需要甲醇激活但易破 碎。膜的规格有 0.45μm 和 0.2μm 两个规格,大于 20kd 的卵白可用 0.45μm 的膜,小于 20kd 的卵白要用 0.2μm 的膜。 NC 膜 活络度和分辩率 布景 连系能力 高 低 80-110 ug/cm2 尼龙膜 高 较高 400 ug/cm2 PVDF 膜 高 低 125-200 ug/cm2(适 合于 SDS 存鄙人取卵白 质的连系) 材料质地 溶剂耐受性 操做法式 合用范畴 干的 NC 膜易脆 无 缓冲液润湿,避免气泡 0.45um 一般卵白 0.2um 一量小于 20kD 卵白 0.1um 一量小于 7kD 卵白 软而健壮 无 缓冲液润湿 低浓度小卵白、 酸性卵白、糖卵白和 卵白多糖(次要用正在 核酸检测中) 价钱 价钱较廉价 廉价 较贵 机械强度高 有 利用前 100%甲醇润湿 糖卵白检测和卵白质测 序 以 PVDF 膜,湿转为例(仅供参考) : 1. 预备好转膜液,将胶浸于转膜缓冲液 10min 摆布。 2. 按照胶的大小剪 PVDF 膜(利用前需要用甲醇处置)和滤纸,放到转膜缓冲液中均衡 10min 摆布。 3. 拆卸转膜,正在海绵上放置 3 层曾经用转膜液浸泡过的滤纸,放置胶,放置处置好的 PVDF 膜,放置 3 层曾经用转膜液浸泡过的滤纸,放置海绵,留意每层之间都不克不及有气 泡,用转膜仪中的支架夹住。 (胶位于负极) 4. 将转膜“三明治”放置到转膜槽中,加转膜缓冲液,将转移槽置于冰浴中。插上电极, 按照卵白量确认转膜的电压/电流,时间。 5. 转膜竣事后,堵截电源,取出 PVDF 膜。 注:转膜后可能分不清膜的标的目的,可正在膜上剪角,有益于判断膜的标的目的。 生工相关产物: 产物编号 产物名称 10X 印迹膜专印缓 产物编号 产物名称 1X Tris-CAPS 印 C520003 冲液 C506044 迹膜转印缓冲液 Western Blot 试剂 10X 高量印迹 C520039 膜转印缓冲液 C620393 盒(兔) ,带 PVDF 膜 Western Blot 试剂 C610393 盒(大鼠) ,带 PVDF 膜 丽春红染色溶液, C520005 5X C600393 Western Blot 试剂 盒(小鼠) ,带 PVDF 膜 封锁及免疫杂交 为了防止抗体和膜非性的连系,插手封锁试剂将其他未连系卵白的区域进行封锁。 封锁的操做步调(仅供参考) : 1. 用适量的 TBS/PBS 洗曾经转好的膜,室温,放到摇床上晃悠。 2. 3. 4. 5. 6. 7. 将膜置于约 25ml 封锁缓冲液中 1h,室温,置于摇床上晃悠。 15ml TBS/T 或 PBS/T 洗膜三次(每次约 5min) 。 插手稀释过的一抗,室温孵育 1~2h 或 4℃留宿,迟缓晃悠。 用 15ml TBS/T 或 PBS/T 洗膜三次(每次约 5min) 。 插手稀释过的二抗,室温孵育 1h,迟缓晃悠 用 15ml TBS/T 或 PBS/T 洗膜三次(每次约 5min) 。 (注:最初一次要用不含 tween 的 溶液清洗) 注:尝试的前提可按照尝试环境进行调整。 生工相关产物: 产物编号 产物名称 WB BSA 封锁液体 产物编号 产物名称 WB 无卵白封锁 C520035 (1X in PBS) WB BSA 封锁液体 C500036 (1X in TBS) 10 x TBS WB 漂洗 C520002 液 10 x TBST C520009 洗液 C510008 10 x PBS WB 漂 WB 漂 C530040 液,2% WB 无卵白封锁 C520041 液,1% in 1X PBS WB 无卵白封锁 C510042 液,1% in 1X TBS 10 x PBST WB 漂 C520004 洗液 C520011 2 x WB 一抗/二抗 洗液 稀释液(in PBS) 显影 显影的方式包罗化学发光法以及生色底物显影法进行尝试。 由于二抗上标识表记标帜分为有 HRP(辣根过氧化物酶)以及 AP(碱性磷酸酶) ,两种二抗可供选 择的方式也分歧。 ? 标识表记标帜 HRP(辣根过氧化物酶)的二抗: 化学发光底物:一般利用 ECL 发光法进行尝试,ECL 中含有 H2O2 和鲁米诺,正在 HRP(辣 根过氧化物酶) 的感化下, 发出荧光来。 生色底物: HRP 的生色底物显影有 DAB, 4-CN , CN/DAB,AEC 和 TMB 等。 ? 标识表记标帜 AP(碱性磷酸酶)的二抗: AP 的生色底物:BCIP,NBT 和 INT。 以标识表记标帜 HRP(辣根过氧化物酶)的二抗,DAB 显影(C520017 辣根过氧化氢酶 DAB 显影试 剂盒)为例: 1.经二抗标识表记标帜及清洗过的膜放正在处。显影前,设置装备摆设新颖的 DAB 显影液并充实混匀。 2. 正在处将显影液插手膜上,将膜笼盖。37℃低速震动反映 10 min 摆布即可。这时浅 棕色的条带呈现。 3. 倒掉反映液,双蒸水冲刷条带 3~4 次,天然干燥。照像记实尝试成果。 生工相关产物: 产物编号 C510043 C500045 C500046 产物名称 ECL 发光试剂 X 线暗盒 X 光 辣根过氧化氢酶 产物编号 C500044 C500047 C500048 产物名称 高活络 ECL 发光试剂 定影粉 显影粉 C520017 DAB 显影试剂盒 超敏型辣根过氧化氢 C510023 酶 DAB 显影试剂盒 INT/BCIP 碱性磷酸 C500033 酶显影试剂 C510025 W-TMB 显影试剂 NBT/BCIP 碱性磷酸 C520019 酶显影试剂 抗体的选择 一抗 一抗的选择 内参抗体 D110001 按照您尝试 (ACTB 抗 的项目和从 体) 要尝试目标 D110016 确定检测目 (GAPDH 的卵白。 抗体) 目标卵白, D110007 决定您选择 (ACTIN 抗 的一抗。 体) 抗体) 抗 抗 (GST 标签 标识表记标帜物) 标识表记标帜二 标识表记标帜二 D110271 (决定二抗的 Biotin AMCA 签抗体) 的检测手段 (FLAG 标 种)+尝试室 记二抗 抗 D110005 种(抗**物 Cy3 标 标识表记标帜二 TRITC 抗体) 一抗发生的物 (6×His 二抗的选择= 记二抗 记二抗 标签抗体 D110002 AP 标 FITC 标 二抗的选择 二抗 二抗标识表记标帜物 D120014 (PCNA 抗体) D110004 HRP 标 (HA 标签 记二抗 抗体) RBITC 标识表记标帜二 抗 成果示企图 Relative protein expression 0.6 0.4 0.2 1 2 3 4 5 6 0.0 pP6 5 ER K 可能呈现的问题 布景遍及偏高或有黑点 可能缘由 封锁不充实 抗体浓渡过高 处理方式 改换合适的封锁剂、耽误封锁时间 抗体浓渡过高会发生高布景,降低抗体浓度 LC 3 抗体孵育温渡过高 封锁剂取一抗或二抗 有交叉反映 洗膜不充实 4℃孵育 改换封锁剂,利用无卵白封锁液 添加洗涤液量和洗涤次数、可利用含 tween20 的洗涤液进行 清洗 膜有问题 NC 膜比 PVDF 膜的布景低、操做过程膜潮湿、反映时要 连结要连结摇动、戴手套操做不消手触碰膜 容器或利用试剂被污 染 转膜时有气泡 抗体分布不均 时间可能过长 每次洗涤的时候利用洁净的容器、制备新的缓冲液 尽量去除气泡,抗体孵育时连结摇动 抗体发生凝固,构成黑点 缩短时间 没有阳性条带或条带很弱 可能缘由 一抗、二抗不婚配 一抗或/和二抗浓度低 卵白转膜不充实 处理方案 订购试剂时认实拔取一抗取组织种属,一抗或二抗不婚配 添加抗体浓度,耽误孵育时间 转膜后利用丽春红 S 检测结果、操纵预染 marker 检测转膜效 果 、转膜时拆卸及标的目的能否准确、膜需要连结潮湿 洗膜过度 目标卵白量较少 洗膜时间不宜过长 提高上样量,裂解液中留意插手卵白酶剂 过度封锁 一抗失效 可考虑改换封锁剂,削减封锁时间 利用无效期内抗体,分拆保留,避免频频冻融取用,工做液现 用现配。 二抗上标识表记标帜的酶失效 利用不含有叠氮化钠的溶液或容器,叠氮化钠 HRP 活 性。 发光底物失效 可将底物取酶标抗体夹杂,察看能否显影,如未显影可能是底 物或是酶标抗体失效。 时间过短 卵白降解 耽误时间 转膜温渡过高、试剂中的某些成分使卵白降解 多非性条带或条带不合错误 可能缘由 目标卵白有多个润色位 点 目标卵白有其他剪切本 样品提取过程中目标蛋 白降解 一抗浓渡过高 一抗性不高 降低抗体浓度,能够削减非性条带 从头选择一抗或制备 处理方案 查阅文献或进行生物消息学阐发,通过去润色确定卵白的现实 大小 查阅文献或进行生物消息学阐发阐发可能性 提取样品时插手卵白酶剂、处置样品时正在冰上操做 转膜不充实 可能缘由 选的膜孔径不合适 卵白等电点等于或接近 转膜缓冲液的 pH 值 甲醇浓渡过高 转膜时间不敷 拆卸时标的目的反了 拆卸时有气泡 处理方案 选择合适孔径的膜 可测验考试利用 CAPS 缓冲液 降低甲醇浓度 对于厚的胶和高量卵白需要耽误转移时间 确定标的目的,转印时卵白从胶转到膜上 拆卸时气泡完全赶尽 条带扩散 可能缘由 抗体浓渡过高 电泳时卵白质上样量过高 处理方案 降低抗体浓度 削减电泳时的卵白质上样量 电泳时可能呈现的问题 问题及可能缘由 目标条带过低/过高:SDS-PAGE 胶浓度不 合适 “浅笑”条带:迁徙过快,电泳温渡过高 处理方案 调整胶浓度,量大的用低浓度的胶, 量小的用高浓度的胶 降低电泳速度,低温电泳 “皱眉”条带:凝胶和玻璃挡板底部有气 泡 电泳前查抄能否有气泡并赶走气泡

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