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卵白提取及WB步调

更新时间:2019-04-26    点击次数:

 

  我们用的是国产碧云天的BCA卵白浓度测定试剂盒。 4)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) (1)凝胶制备:

  (1)半干转膜仪转膜(具体和尝试室机子相关):剪取凝胶大小分歧的PVDF膜一张(膜用之前的处置:甲醇浸泡min,ddH2O浸泡5min,然后和滤纸一路泡到转缓里),滤纸12张,浸泡于转膜缓冲液中至多20 min,先将滤纸逐层置于转膜仪上,用下胶尺逐层赶尽气泡,加上PVDF膜,赶尽膜取滤纸间的气泡,将聚丙烯酰胺凝胶放正在PVDF膜上,赶尽凝胶取尼膜之间的气泡,逐层加上滤纸,要尽量排放划一;按照0.8 mA/cm2~1 mA/cm2的功率恒流转膜2 h~2.5 h。留意正负极。

  (3)电泳:浓缩胶10 mA恒流电泳至交壤处,分手胶20 mA恒流电泳至溴酚蓝达到凝胶下缘,可按照卵白量的大小确定电泳的;

  步调:按下列系统设置装备摆设溶液,混匀后,静置5 min后,测OD值(波长595 nm),将OD值输入Excel进行数据处置,计较出相关系数,当相关系数0.99才具有可托度。取待测标本,准确设置reference,取适量标本,进行浓度测定。

  (4)4 ℃,12000 g 离心30 min,吸上清,分安拆于-70 ℃待用。 3)卵白浓度测定(Bradford法) 试剂配制:

  置于通风橱内搅拌曲至丙烯酰胺完全消融,用0.45 μm微孔滤膜过滤后4 ℃保留于棕色瓶中备用。

  步调:将电泳槽安拆安拆好,按照需要量设置装备摆设分手胶,灌注,用饱和正丁醇封液面,室温30 min~60 min待胶凝固后,去除正丁醇,配制浓缩胶,灌注,将加样梳放入,室温30 min~60 min待胶凝固后即可上样电泳;

  (2)将PVDF膜放入含5%脱脂奶粉的TBS中封锁2 h; (3)插手5%脱脂奶粉稀释的一抗,4 ℃留宿; (4)次日用TBS洗3次,每次10 min; (5)插手HRP连系的二抗,37 ℃,1 h; (6)TBS洗4次,每次10 min;

  (1)取组织,称沉,按照W:V = 1:6的比例插手卵白裂解液; (2)用匀浆器对组织进行匀浆,匀成糊状。 (3)4 ℃,冰上放置30min,每10 min振荡一次;

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